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鴿子性別檢測試劑

2025-04-21·150 瀏覽

鴿子性別檢測試劑

鴿子性別檢測試劑(帶內參,PCR-熒光探針法)

本試劑盒可對鴿的羽毛、血液及組織等樣品中CHD-W保守基因進行擴增檢測,進而對鴿的性別進行鑒定。通過引入內源性內參可對核酸提取和擴增過程進行監測,確保檢測結果的準確性。


鴿子性別檢測試劑產品內容:

試劑組分AN2306002-03(100T)
GW反應液1150μL
GW預混液1150μL
GW陽性對照100μL
陰性對照100μL


鴿子性別檢測試劑儲存條件:

-20℃條件下保存,有效期至少12個月。


鴿子性別檢測試劑實驗操作:

1.樣本制備(樣本制備區)

1.1樣本要求:

羽毛:采集胸部、腹部或腿部羽毛(含羽根部分)不少于5根,切勿使用自然脫落的羽毛。

全血:使用EDTA作為抗凝劑,切勿使用肝素抗凝,要求使用新鮮全血,或在2~8℃不超過7天,或在-20℃條件下保存不超過3個月,應盡量避免反復凍融。

組織:采取新鮮肌肉或器官組織(盡可能不使用皮或者筋膜等不易處理樣本)不超過100mg,使用200-500μL無菌水制備組織勻漿液,再進行后續樣本制備。

1.2樣本制備:

請參照三獅生物《動物基因組DNA快速提取試劑盒(PCR分析用)說明書》(貨號:DP202),或其他符合相關要求的核酸提取試劑盒/方法,對處理后的樣品進行核酸提取。提取的樣品核酸放置于冰盒中,并盡量及時進行檢測,4℃保存不超過7天或-20℃保存不超過6個月。

2.配制反應體系(加樣區)

2.1取出試劑盒中各組分,室溫條件下完全解凍,離心10秒,將管壁和管蓋內的液體離心至管底;按樣本數量(n+2)(即n個待檢樣本+1個陽性對照+1個陰性對照)配制反應體系,具體配制方法如下:分別吸取((n+2)×11.5μL GW反應液+(n+2)× 11.5μL GW預混液)加入潔凈離心管中,移液器吹吸充分混勻,分裝至PCR管中,每孔23μL,放在冰盒中備用。

2.2 然后向反應液中依次添加2μL陰性對照、提取的樣本核酸和GW陽性對照,蓋好管蓋,做好記錄,每個反應總體積為25μL。充分混勻,離心10秒后在PCR儀上進行擴增實驗。

3.PCR擴增(擴增及產物分析區)

95℃預變性3分鐘;95℃變性10秒,58℃退火延伸30秒,35個循環,在58℃時收集熒光信號。熒光第一通道選擇FAM(CHD-W基因),第二通道選擇VIC/HEX(內源性內參基因)(使用ABI系列實時熒光定量PCR儀,若有需求可提前聯系廠家或自行添加ROX校正染料;否則參照正常程序進行)。 

4.結果判定

4.1陽性對照FAM通道和VIC/HEX通道的Ct值均<28且出現“S”型擴增曲線,陰性對照無Ct值或Ct值≥35且無“S”型擴增曲線,實驗結果有效;否則應重新進行實驗,如重測實驗仍無效,請與廠家技術人員聯系。

4.2樣本VIC/HEX通道的Ct值應≤30且出現“S”型擴增曲線,表明樣本提取和擴增有效;如VIC/HEX通道無Ct值或Ct值為30<Ct≤35,表明樣本核酸提取不達標或存在較強抑制干擾物(如酒精等消毒劑、抗凝劑等殘留)抑制擴增,建議重新處理樣本進行核酸提取及擴增;

4.3樣本VIC/HEX通道檢測有效后,再進行FAM通道的判定:

Ct值≤30且出現“S”型擴增曲線,判定為CHD-W基因陽性,表明樣本來源于雌性;

Ct值為30<Ct<32,則均判定為可疑,建議進行復測(建議先排除環境氣溶膠污染導致的“假陽性”結果,再重新進行核酸提取及檢測),如排除氣溶膠污染后FAM通道復測Ct值<30,且有明顯的擴增曲線,判定為CHD-W基因陽性,否則判定為陰性;

無Ct值或Ct值≥32且無“S”型擴增曲線,判定為CHD-W基因陰性,表明樣本可能來源于雄性。


鴿子性別檢測試劑注意事項:

1)為了防止污染,實驗需要嚴格進行分區操作,分區之間最好進行物理性隔離,避免人為因素造成交叉污染。實驗過程中穿戴工作服和乳膠手套,不同區域獨立使用工具,需更換手套和實驗服。PCR結束后,切勿立即開蓋,充分冷卻后再開蓋取樣,最大程度避免氣溶膠污染。

2)試劑使用前要完全解凍,但應避免反復凍融。試劑配制和加樣等步驟請嚴格按照說明書要求進行操作。操作臺、離心機及移液器等儀器應定期使用含氯消毒劑、消毒酒精、核酸污染清除劑或紫外燈進行消毒。

3)檢測結果為陰性,并不完全代表為雄性,核酸樣本發生未知突變、質量不合格、載量過低、存在較強干擾抑制物導致核酸提取(檢測)不成功亦會產生“陰性”結果。本試劑盒僅用于鴿中CHD-W基因的特異性擴增,涉及的其他產品請詳詢生產廠家。

4)本品為一次性用品,試劑中的組分對于自然光較為敏感,分裝及保存時注意遮光,請勿反復凍融,僅供科學研究,不用于臨床診斷等其他用途。

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